毕赤酵母是目前最常用的真核表达宿主之一，但遗传操作效率低且流程繁琐，因而构建并优化其分泌型遗传操作工具，对提高毕赤酵母应用价值具有重要意义。本研究以α-淀粉酶为报告蛋白，首先通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒；其次借助通用引物和POE-PCR，快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽；最后构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明，非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍；以FLO10、EXG1和MSB2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍；亚磷酸脱氢酶基因（ptxD）成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。本研究简化了基因操作流程，改进了遗传操作工具，开发了绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记，为毕赤酵母分泌表达系统的应用推广奠定基础。